Полимеразная цепная реакция
ПЦР — новое достижение молекулярной генетики, используется для амплификации ДНК и позволяет быстро размножить in vitro специфический
участок ДНК (то есть любой интересующий ген) более чем в 200 000 раз. Чтобы провести реакцию, достаточно иметь ДНК-материал одной клетки; количество амплифицированной с помощью ПЦР ДНК столь велико, что эту ДНК можно просто окрашивать (использование радиоактивных зондов после электрофореза не требуется). Необходимое условие для проведения ПЦР — знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК для правильного подбора искусственно синтезированных прай-меров.
В настоящее время ПЦР представляет собой процесс, протекающий в одной пробирке и состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования) специфической последовательности молекулы ДНК с целью получения достаточно большого количества копий, которые могут быть идентифицированы методом электрофореза. Один из ключевых компонентов реакции — «праймеры» — синтетические олигонуклеоти-ды, состоящие из 20-30 оснований, комплементарных «сайтам» (участкам) отжига (присоединения) на идентифицируемом участке матричной ДНК.
ПЦР протекает автоматически в программируемом термостате — термо-циклере (амплификаторе). Трёхступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной ДНК, повторяют 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоцикле-ра. В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в реакционной смеси. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не вследствие изменения температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразной границы амплифициро-ванного участка, что и определяет размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.
В качестве метода детекции полученных молекул ДНК используют электрофорез, с помощью которого производится разделение амплифи-цированного материала по размеру ампликонов (продуктов амплификации).
С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК.